2024寧夏吳忠知識大全：細胞復蘇能不洗嗎@網站小助手

【2024寧夏吳忠知識大全：細胞復蘇能不洗嗎@網站小助手】：今天小視頻助手分享的內容是——細胞復蘇的步驟,,,,，小視頻將詳細內容整理如下： 求細胞復蘇方法步驟和注意事項

提示：

求細胞復蘇方法步驟和注意事項

博凌科為解答：【材料】1.常規細胞培養儀器設備 恒溫水浴振蕩器。2.培養液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞砜（DMSO）【操作程序】1.細胞實驗室進行常規消毒，紫外照射40min以上。2.培養液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預熱20min，備用。3.二甲基亞砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，備用。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min，5min）。6.用培養液懸液混懸沉淀細胞，調整細胞濃度，方培養箱中培養。7.記錄復蘇日期。【注意事項】1.取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作 較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進口產品。3.離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。4.離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大， 死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液 體前倒凈，且一定倒干凈。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行復蘇，結果無有異常。5.細胞貼壁少的問題：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養液，而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附。6.復蘇細胞分裝的問題：試驗中我的經驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養瓶中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。7.加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響 細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。

細胞復蘇的步驟

提示：

細胞復蘇的步驟

真核細胞通常懸浮在帶有血清和冷凍劑的培養基內，保存在-196°C 的液氮中。如果是商業訂購的，通常儲存在用干冰包裹的凍存管中。所以凍存后的細胞必須快速解凍后立即培養，以獲得最大的生存能力，為了除去凍存時的添加劑， 24 小時后要更換培養基。

一、材料

培養基， 37’C 預熱

培養瓶

裝有70 ％乙醇的燒杯

1ml 、10ml 的移液管、移液器及移液頭

二、步驟

把凍存細胞的管子在37’C 的水浴融化，快速搖動， 1分鐘內使管內的細胞融化。

把融化的管子浸入裝有70 ％乙醇的燒杯內，整個實驗在超凈臺內進行。

小心打開凍存管，不要讓乙醇浸入管內。

將凍存管內的細胞轉移到培養瓶中，并立即加入預熱的培養基。

蓋好培養瓶的蓋子，培養24 小時。

用新培養基替換老培養基。

繼續培養2~3 天或按說明書上的建議進行操作。

三、溫馨提示

1.融解的細胞必須馬上培養，如果來不及培養，就保存在液氮中。

2.細胞通常凍存為1 ml 的體積，加入新的培養基至10ml 。

3.可以在融化了凍存細胞后，把細胞離心下來，并用新鮮的培養基重新懸浮細胞，這種做法只適用于那些對凍存劑敏感的細胞，或者笫二天因為有事不能更換新培養基的情況。

細胞復蘇不活，怎么回事

提示：

細胞復蘇不活，怎么回事

可以從以下三方面查找原因：
1、凍存前的消化過程：雜交瘤細胞為半貼壁細胞，有可能你的消化程度沒有掌握好，致使消化過度。
2、收集細胞的離心操作：細胞消化后進行離心，以收集細胞，如果離心速度太大對細胞也會損傷有加，一般要求離心速度是不大于1000rpm，時間不多于5min，溫度是室溫。
3、凍存過程：該過程是個逐漸降溫的過程，不能降溫太急劇，一般是4度放置20min，-20度放置不超過30min（最好不要超過30min），然后放入超低溫冰箱或液氮中保存。你的細胞在-20度放置的時間太長了。
4、復蘇過程：與凍存過程相比，復蘇過程要求盡量短時間內完成操作，從超低溫冰箱取出凍存管直接在37度水浴溶解，一邊搖動幫助溶解。