當前位置：視頻教程網(wǎng) > 學科教程 > 正文
發(fā)布：2023-09-18 09:53:00編輯：視頻君來源：視頻教程網(wǎng)
以下是根據(jù)NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干細胞培養(yǎng)protocol整理而成。根據(jù)經(jīng)驗作部分修改。
1、一般培養(yǎng)-保持胚胎干細胞處于未分化狀態(tài)
培養(yǎng)基
細胞復蘇
凍存細胞
明膠包被
細胞傳代
2 、體外分化
培養(yǎng)基
包被有多聚鳥氨酸/纖維結合蛋白的培養(yǎng)板（使用或不使用蓋玻片）
體外分化方法
注：以下培養(yǎng)針對于小鼠的R1胚胎干細胞系，其它胚胎干細胞的培養(yǎng)可以參考。不過人的胚胎干細胞培養(yǎng)不可以采用下面的protocol，需要用專用的protocol和培養(yǎng)基。
一般培養(yǎng)——維持ES細胞處于未分化狀態(tài)
ES細胞培養(yǎng)用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed細胞的培養(yǎng)基（高糖）來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。如果在Feed細胞，那么就需要采用MMC進行處理，抑制Feed細胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細胞。Feed細胞可以來源于STO細胞或原代胚胎成纖維細胞。
培養(yǎng)基
ES：
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基——見下文）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養(yǎng)基，0.22 μm濾膜過濾。貯存于4℃，時間不要超過2周。
貯存液
DMEM（高糖）
馬血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST
LIF
復蘇細胞
細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結晶的形成，結晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。
步驟：
1.從液氮中取出一管細胞；
2.將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內溶液恰好完全溶解）；
3.將細胞轉移到一15ml Falcon管中；
4.加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；
5.離心3分鐘；
6.棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞，至少吹打10次；
7.接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；
8.孵育。
做實驗之所以常用小白鼠，主要有以下幾個原因：
第一：老鼠中的小白鼠的基因序列和人類的差不多，它的全基因組和人類的相似度極高，很多人類難以治愈的疾病可以在小白鼠身上找到相似性狀，從而加以實驗發(fā)現(xiàn)治病基因。
第二：實驗專用白鼠的生物學意義較大，培育出的小鼠幾乎完全沒有個體差異(生理上)。生理上沒有個體差異是否意味著氣質上沒有差異尚不明了，不過選擇純系實驗白鼠主要還是為了盡可能的減少先天的個體差異。
第三：數(shù)量充足，許多實驗需要統(tǒng)計學分析，這就要求一定的數(shù)量，大白鼠和小白鼠，特別是小白鼠，在人工繁殖條件下，能滿足這一要求。還有動物等級，小白鼠好歹也是哺乳動物，除了體形小，與其它哺乳動物的進化水平相比并不差。體形小反而成為人工繁殖喂養(yǎng)的有利條件。
第四：其實很多實驗用猩猩等與人更近似的動物做最好，但使用猩猩太昂貴了。許多實驗，比如認知類的，實驗結束后時需要將動物殺死，來檢查其內部變化的。這樣，大量的實驗肯定就不能用比較“貴重”的猩猩了。
第五：由于這種大型的哺乳動物受到動物保護協(xié)會的保護。那么多不“人道”的實驗也就受到限制了。即使用的是小白鼠，動協(xié)的人仍然有抗議呢。
第六：一些實驗用不著那些大型的，復雜的動物來做。
會計基礎:03復式記賬0
會計基礎: 03復式記賬
會計基礎: 03復式記賬
會計基礎:03復式記賬0
會計基礎: 02會計科目
會計基礎:02會計科目
會計基礎:01總論04會
會計基礎:01總論03會
水下蝶泳視頻教程
自由泳換氣動作糾正視
蛙泳教學視頻全集完整
蛙泳腿部錯誤動作—不