dtt配制

DTT是一種很強的還原劑，其還原性很大程度上是由于其氧化狀態六元環（含二硫鍵）的構象穩定性。它的氧化還原電勢在pH為7時為-0.33伏。
DTT的用途之一是作為巰基化DNA的還原劑和去保護劑。巰基化DNA末端硫原子在溶液中趨向于形成二聚體，特別是在存在氧氣的情況下。這種二聚化大大降低了一些偶聯反應實驗（如DNA在生物感應器中的固定）的效率；而在DNA溶液中加入DTT，反應一段時間后除去，就可以降低DNA的二聚化。
DTT也常常被用于蛋白質中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質分子內或分子間二硫鍵。但DTT往往無法還原包埋于蛋白質結構內部（溶劑不可及）的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先將蛋白質變性（高溫加熱或加入變性劑，如6M鹽酸胍、8M尿素或1%SDS）。反之，根據DTT存在情況下，二硫鍵還原速度的不同，可以判斷其包埋程度的深淺。

　　理工學科是指理學和工學兩大學科。理工，是一個廣大的領域包含物理、化學、生物、工程、天文、數學及前面六大類的各種運用與組合。
　　理學
　　理學是中國大學教育中重要的一支學科,是指研究自然物質運動基本規律的科學,大學理科畢業后通常即成為理學士。與文學、工學、教育學、歷史學等并列，組成了我國的高等教育學科體系。
　　理學研究的內容廣泛，本科專業通常有：數學與應用數學、信息與計算科學、物理學、應用物理學、化學、應用化學、生物科學、生物技術、天文學、地質學、地球化學、地理科學、資源環境與城鄉規劃管理、地理信息系統、地球物理學、大氣科學、應用氣象學、海洋科學、海洋技術、理論與應用力學、光學、材料物理、材料化學、環境科學、生態學、心理學、應用心理學、統計學等。

　　工學
　　工學是指工程學科的總稱。包含 儀器儀表 能源動力 電氣信息 交通運輸 海洋工程 輕工紡織 航空航天 力學生物工程 農業工程 林業工程 公安技術 植物生產 地礦 材料 機械 食品 武器 土建 水利測繪 環境與安全 化工與制藥 等專業。

要回答這個問題，首先需要理解樣品前處理需要達到的目的：減少人為降解和修飾，并且盡量多的釋放肽段。

整個過程可以分為以下流程：先從組織、體液或細胞中提取蛋白質，拿到蛋白混合溶液（根據你的研究目的，可以對蛋白先做分離，或者不分離），接下來還原烷基化（還原的過程是將蛋白的二硫鍵打開，然后烷基化可以修飾巰基，防止游離的巰基再生成二硫鍵）處理，并酶解成肽段。

1，樣品的收集與保存

組織樣品

1) 對于人體切除的組織，有條件的話，最好用PBS（磷酸緩沖鹽溶液，作為溶劑，起溶解保護試劑的作用）取完之后直接去血。如果沒有去血，可以-80℃液氮保存，干冰運輸。

2）對于小鼠、大鼠、兔子之類的組織樣品，建議用灌流的方式來去血，尤其是像肝臟、胃、心臟這類大的組織，可以直接用灌流的方式去血，去得最干凈。其次的方案是在后期剪碎的時候去血。

細胞樣品

常規實驗，建議收到5*1E6~1E7個細胞以上的樣品量（有些實驗需要的樣品量會少一些，后面會詳細講）。細胞取好后，首先用PBS清洗一下細胞表面，因為大部分培養基里面都含有血清，這部分血清得洗干凈了先~

如果是做分泌蛋白研究的話，首先用PBS清洗樣品幾次，再用條件培養基（不含有血清的培養基）進行培養，根據細胞情況，大概12個小時以后，離心，去掉細胞碎片，取上清，就能提取到分泌蛋白了。

血清樣品

1）血漿樣品：可以通過常用的EDTA抗凝管進行收集，收集到的血漿會呈懸浮狀態，離心去掉血細胞。

2）血清樣品：現在大部分研究都直接針對血清樣品，它的成份更簡單，沒有凝集素，沒有大量的血細胞，針對性會更強。收集血清樣品時，直接把血清吸到管子里，室溫靜置讓它凝結，上清黃色部分就是血清樣品啦。
2，研磨或超聲破碎樣品，為了減少人為操作引入的修飾，通常會準備大量的冰，進行冰上的操作。同時還需要加入蛋白酶抑制劑，防止在操作過程中蛋白被樣品中自帶的蛋白酶降解掉。

3，充分熔接蛋白質，如果蛋白沒有充分溶解，能提取到的蛋白就會很少，達不到研究目的。

4，充分解旋蛋白質，通常，蛋白質都是成球狀的穩定狀態，解旋蛋白質就是將球狀蛋白中的二硫鍵打開，讓它形成鏈狀結構，以便進行下一步酶切。

5，酶解蛋白質，一般會用多種酶對蛋白質進行酶解。

6，去除雜質，我們要知道，質譜是一個非常靈敏的儀器，它檢測的是多肽的質荷比。所有的鹽類，以及所有會進行離子化的雜質，都會干擾到肽段的檢測。所以我們會要求進入質譜之前的蛋白樣品非常干凈。在蛋白水平及肽段水平都會進行去除雜質的步驟。

更詳細的，下次再聊~

IPG 膠條平衡兩次，每次15 分鐘。平衡緩沖液包括6 M 尿素和30% 甘油，會減少電內滲，有利于蛋白從第一向到第二向的轉移。第一步平衡在平衡液中加入DTT，使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態；第二步平衡步驟中加入碘乙酰胺，使蛋白質巰烷基化，防止它們在電泳過程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使殘留的DTT 烷基化(銀染過程中，DTT 會導致點拖尾"point streaking") 。將IPG 膠條輕輕潤洗，并去除多余的平衡緩沖液，然后放入第二向SDS 膠中。

因為有些蛋白有半胱氨酸的存在，所以會形成很多-SH鍵來維持蛋白質的高級結構又因為-SH鍵具有很強的還原性，為了避免-SH被氧化而造成蛋白失去活性，所以需要加入DTT來保護-SH鍵不被還原掉。但是DTT量太高的話又會破壞掉二硫鍵。也就是說DTT濃度太低起不到保護作用，濃度太高又會破壞結構。所以如果一些蛋白需要添加的話一般是建議在0.5mM~1.5mM之間。 以摩爾數計算，5-10倍的量來保護-SH。如果蛋白報存buffer中含有15%左右的甘油，對蛋白具有很好的穩定作用。補充一點：如果dtt和蛋白摩爾比例比例增大到1：100，DTT就能破壞2硫鍵了，這時對應的濃度一般在10mM左右。

稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH
范圍內。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶.
（一）水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利于蛋白質的溶解.提取的溫度要視有效成份性質而定.一方面,多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利于溶解,縮短提取時間.但另一方面,溫度升高會使蛋白質變性失活,因此,基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫（5度以下）操作.為了避免蛋白質提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等）.
（二）有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶,不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必須在低溫下操作.丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內（度為10%,40度為6.6%）不會引起酶的變性失活.另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用于動植物及微生物材料.,5,